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*法 DNA探針雜交法
供試品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA，稱(chēng)為雜交。將特異性單鏈DNA探針標(biāo)記后，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽(yáng)性DNA對(duì)照比對(duì)后，可測(cè)定供試品中外源性DNA的含量。
試劑（1）DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒 （2）DNA雜交膜尼龍膜或硝酸纖維素膜。
（3）2%蛋白酶K溶液 稱(chēng)取蛋白酶K 0.20g，溶于滅菌水10ml中，分裝后儲(chǔ)藏于-20℃?zhèn)溆谩?nbsp;
（4）3%牛血清白蛋白溶液 稱(chēng)取牛血清白蛋白0.30g，溶于滅菌水10ml中。 （5）1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用鹽酸調(diào)pH值至8.0。 （6）5.0mol/L氯化鈉溶液
（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0） 用10mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。
（8）20%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液 用鹽酸調(diào)pH至7.2。
（9）蛋白酶緩沖液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化鈉溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液 2.5 ml， 加滅菌水至10ml。
（10）TE緩沖液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）2ml，加滅菌水至1000ml。
（11）1%魚(yú)精DNA溶液 精密稱(chēng)取魚(yú)精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE緩沖液溶解并稀釋至刻度， 搖勻，用7號(hào)針頭反復(fù)抽打以剪切DNA成為小分子，分裝后貯藏于-20℃?zhèn)溆谩?nbsp;
（12）DNA稀釋液 取1%魚(yú)精DNA溶液50μl，加TE緩沖液至10ml。
用于探針標(biāo)記和陽(yáng)性對(duì)照的DNA制備 用于探針標(biāo)記和陽(yáng)性對(duì)照的DNA，由生產(chǎn)供試品用的傳代細(xì)胞、工程菌或雜交瘤細(xì)胞提取純化獲得，其提純和鑒定可參考下述推薦方案進(jìn)行，具體方法可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（［美］J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002）或《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（［美］F.奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f、王海林譯，科學(xué)出版社，1998）。
將待提取的細(xì)胞基質(zhì)懸液的細(xì)胞濃度調(diào)整為每1ml含107個(gè)細(xì)胞，如果為細(xì)菌，則將其濃度調(diào)整為每1ml含108個(gè)細(xì)胞細(xì)菌。取懸液1ml，離心，在沉淀中加裂解液400μl混勻，37℃作用12～24小時(shí)后，加入飽和酚溶液450μl，劇烈混合，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液體，以飽和酚溶液450μl重復(fù)抽提一次；轉(zhuǎn)移上層液體，加入三氯jia烷450μl，劇烈混勻，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；轉(zhuǎn)移上層液體，加入pH 5.2的3mol/L醋酸鈉溶液40μl，充分混合，再加入-20℃以下的無(wú)水乙醇1ml，充分混合，-20℃以下作用2小時(shí)，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘；用適量-20℃70％乙醇溶液洗滌沉淀1次，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加適量滅菌TE緩沖液溶解，RNase酶切，酚/三氯jia烷抽提，分子篩純化DNA，即得。
用1%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法鑒定陽(yáng)性對(duì)照品的DNA純度：應(yīng)無(wú)RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值應(yīng)在1.8～2.0之間（測(cè)定時(shí)將供試品稀釋至A260為0.2～1.0）。
用于陽(yáng)性對(duì)照和標(biāo)記探針的DNA在使用前應(yīng)進(jìn)行酶切或超聲波處理，使其片斷大小適合于DNA雜交和探針標(biāo)記。
陽(yáng)性對(duì)照品的DNA濃度根據(jù)下式計(jì)算
DNA濃度（ng/μl）= 50×A260
陽(yáng)性對(duì)照品可分裝于適宜的小管中，-20℃以下保存，長(zhǎng)期使用。 探針的標(biāo)記 按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
測(cè)定法 （1）蛋白酶 K預(yù)處理 按下表對(duì)供試品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行加樣，混合后37℃保溫4小時(shí)以上，以保證酶切反應(yīng)*。
注意事項(xiàng)：供試品的稀釋
根據(jù)成品zui大使用劑量，用DNA稀釋液將供試品（原液）稀釋至每100μl 含1人份劑量；如成品zui大使用劑量較大，而供試品的蛋白含量較低，可用DNA稀釋液將供試品稀釋至每100μl 含1/10人份劑量或每100μl含1/100人份劑量。
D1、D2、D3為稀釋的陽(yáng)性DNA對(duì)照。用DNA稀釋液稀釋至每1ml中含DNA 1000ng。然后依次10倍稀釋成10ng/100μl (D1)、1ng/100μl (D2)、100pg/100μl (D3)三個(gè)稀釋度；如成品使用劑量較大，而且DNA*（100pg/劑量）較嚴(yán)格時(shí)，則需要提高DNA檢測(cè)靈敏度，相應(yīng)的陽(yáng)性DNA對(duì)照應(yīng)稀釋成100pg /100μl (D1)、10pg /100μl (D2)、1pg/100μl (D3)三個(gè)稀釋度。陰性對(duì)照為DNA稀釋液，空白對(duì)照為未進(jìn)行蛋白酶 K預(yù)處理的TE緩沖液。
當(dāng)供試品1/100人份劑量大于100μl時(shí)，終體積也隨之增大，一般終體積為供試品體積的一倍左右，供試品體積和終體積相差過(guò)小，可能會(huì)影響蛋白酶 K的活性。
2％蛋白酶 K溶液和蛋白酶緩沖液的比例為1/20，蛋白酶緩沖液和終體積的比例為1/10。
加入3％牛血清白蛋白溶液適量，是為了使陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照中含有一定的蛋白質(zhì)與供試品（通常為蛋白質(zhì)）的酶切條件保持一致；如供試品為其他物質(zhì)，則應(yīng)改用其他相應(yīng)物質(zhì)。
若預(yù)處理后的供試品溶液中的蛋白質(zhì)干擾本試驗(yàn)，可用上述飽和酚溶液抽提法或其他適宜方法提取供試品DNA（陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照也應(yīng)再次提取DNA，與供試品溶液平行）。 （2）點(diǎn)膜 用TE緩沖液浸潤(rùn)雜交膜后，將預(yù)處理的供試品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照與空白對(duì)照置100℃水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻，以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒。用抽濾加樣器點(diǎn)樣于雜交膜(因有蛋白質(zhì)沉淀，故要視沉淀多少確定加樣量，以避免加入蛋白質(zhì)沉淀。所有供試品與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照加樣體積應(yīng)一致，或按同樣比例加樣)。晾干后置80℃真空干烤1小時(shí)以上。
（3）雜交及顯色 按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
結(jié)果判定 陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)顯色，其顏色深度與DNA含量相對(duì)應(yīng)，呈一定的顏色梯度；陰性、空白對(duì)照應(yīng)不顯色，或顯色深度小于陽(yáng)性DNA對(duì)照D3，試驗(yàn)成立。將供試品與陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量。
第二法 熒光染色法（新增）
PicoGreen是一種高靈敏度雙鏈DNA熒光染料。該染料與雙鏈DNA特異結(jié)合形成復(fù)合物，在波長(zhǎng)480 nm激發(fā)下產(chǎn)生*熒光信號(hào)，可用熒光酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行檢測(cè)，在一定的DNA濃度范圍內(nèi)以及在該熒光染料過(guò)量的情況下，熒光強(qiáng)度與DNA濃度成正比，根據(jù)供試品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算供試品中的DNA殘留量。
試劑 （1）20×TE緩沖液（200 mM Tris-HCl，20 mM EDTA，pH7.5） 加滅菌水配置成1×TE。
（2） PicoGreen染料 用1×TE緩沖液將PicoGreen染料稀釋200倍，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并注意避光。
（3） DNA標(biāo)準(zhǔn)品 取DNA標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于TE中，制成100 μg/ml DNA標(biāo)準(zhǔn)品，于-20℃條件下保存。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 用1×TE緩沖液將DNA標(biāo)準(zhǔn)品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
測(cè)定法 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各400錯(cuò)誤！未找到引用源。l于1.5ml 離心管中，分別加入稀釋后的PicoGreen染料400 錯(cuò)誤！未找到引用源。l，混勻后，避光室溫放置5 分鐘。取250錯(cuò)誤！未找到引用源。l上述反應(yīng)液于96孔板黑色酶標(biāo)板中，并做3個(gè)復(fù)孔。用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)480nm、發(fā)射波長(zhǎng)520nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。以1×TE緩沖液測(cè)得的熒光強(qiáng)度為本底，測(cè)定和記錄各測(cè)定孔的熒光值。 用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（ng/ml）對(duì)其相應(yīng)的熒光強(qiáng)度作直線回歸（相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于？），將供試品溶液的熒光強(qiáng)度代入回歸方程，求出供試品的殘余DNA含量（ng/ml）。
注意事項(xiàng) （1）該法DNA檢出限為0.3 ng/ml。DNA含量在1.25-80 ng/mL范圍線性較好，因此供試品DNA含量在該范圍內(nèi)可定量測(cè)定；當(dāng)DNA含量低于1.25 ng/mL時(shí)應(yīng)為*，表示為小于1.25 ng/mL。
（2）若供試品對(duì)回收率和精密度無(wú)干擾，則可直接測(cè)定。
（3）若精密度好，但供試品輕微干擾回收率時(shí)，無(wú)需對(duì)供試品DNA做進(jìn)一步純化，可直接測(cè)定，但每次測(cè)定均應(yīng)增加回收率實(shí)驗(yàn)，并用回收率對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。
（4）若供試品嚴(yán)重干擾回收率和精密度時(shí)，應(yīng)采用適宜方法（參見(jiàn)本項(xiàng)目*法）純化DNA以排除干擾，直至精密度和回收率試驗(yàn)均符合要求。需要純化DNA后再進(jìn)行測(cè)定的供試品，每次測(cè)定均應(yīng)從純化步驟起增加回收率實(shí)驗(yàn)，并用回收率對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。
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