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CTC基因組與轉(zhuǎn)錄組測序方法

一般來說，CTC測序工作流程可分為四個步驟：CTC富集，CTC分離（特別是單細胞CTC或純CTC分離），基因組或轉(zhuǎn)錄組擴增，測序和分析。

CTC富集

目前已經(jīng)報道了幾種用于從癌癥患者血液富集CTC成功的方法。一般來說，這幾種方法都使用了兩種策略。zui常見的策略是利用細胞表面CTC標(biāo)記物進行富集（EPCAM +，CK +，CD44 +）或刪除其中的免疫細胞（CD45 - ）。其代表性平臺包括CellSearch，MagSweeper和GILUPI細胞收集器等。另一種富集策略是利用CTCs的大小，密度，聲學(xué)，流體力等物理特性將CTC從白細胞群體中分離出來，代表性的平臺包括ClearCell，ISET。

目前采用的CTC富集系統(tǒng)方法通常將細胞表面標(biāo)記和物理特性相結(jié)合，雖然提高了提高了CTC鑒定的效率和準(zhǔn)確性；減少了對DNA,RNA的損傷，但它們都需要至少7.5ml以上的外周血。而GILUPI細胞收集器則通過從外周血液中收集體內(nèi)的CTC來克服小血液樣本所造成的富集困難問題。

CTC分離

CTC從血液中富集后，需將零至數(shù)百個CTC從背景細胞中提取出來，科學(xué)家通常使用激光捕獲顯微切割（LCM）和流式細胞儀分析（FACS）。LCM和FACS各有各的優(yōu)缺點。與LCM相比，F(xiàn)ACS以高通量自動地將具有正確標(biāo)記的特定單個細胞分離成管或孔，而LCM方法允許觀察細胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)，以防止可能的污染或細胞損傷。從這個系統(tǒng)分離的細胞是保持生物學(xué)特性的，并保留完整的遺傳信息，可用于測序和基因表達分類。

基因組或轉(zhuǎn)錄組擴增

在從全血獲得靶細胞后，應(yīng)擴增遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生足夠的模板以創(chuàng)建NGS文庫。對于全基因組擴增（WGA），科學(xué)家們使用線性或基于PCR的擴增方法；對于全轉(zhuǎn)錄組擴增（WTA），開發(fā)諸如CEL-seq，STRT-seq和SMART-seq的方法以擴增全轉(zhuǎn)錄組或其3'區(qū)域。大多數(shù)這些擴增方法已經(jīng)實現(xiàn)試劑盒商業(yè)化。

測序和分析

獲得足夠的遺傳物質(zhì)后，NGS庫準(zhǔn)備就緒并在標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議下進行測序。在從CTC獲得測序數(shù)據(jù)之后，zui重要的程序是在樣品制備期間評估偏差并設(shè)計適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計模型以處理這些偏差。

檢測腫瘤進展期間臨床相關(guān)的基因變異

癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是臨床治療的主要挑戰(zhàn)，也是癌癥患者死亡的主要原因。與原發(fā)腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性腫瘤的癌細胞有新的體細胞變異，這增強了治療過程中的癌細胞逃逸性。在臨床實踐中，通常難以獲得來自轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性腫瘤的再活檢，這導(dǎo)致治療期間的模糊診斷結(jié)果。而液體活檢則通過對來自CTC的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進行測序，使得研究人員在沒有活檢測序的情況下觀察了腫瘤譜中的體細胞變化，這成為基因測序中的一大突破。

推測腫瘤的異質(zhì)性和進化動態(tài)

通常癌癥被認為是達爾文進化的結(jié)果，因為癌癥在單個細胞中不斷獲得新的體細胞突變，然后經(jīng)過選擇增強特定惡性細胞的適應(yīng)性和生長優(yōu)勢。理解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）和進化對疾病復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)和癌癥的有效治療至關(guān)重要。目前有三個主要的假設(shè)模型解釋ITH，包括克隆進化，癌癥干細胞和增變表型模型。與僅測序原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞相比，測序CTC提供了額外的數(shù)據(jù)以進一步探索ITH的復(fù)雜性。另外，由于外周血中CTC的存活是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要步驟，所以對CTC基因組進行測序可以描繪出更詳細的腫瘤演進過程，有助于了解腫瘤轉(zhuǎn)移機制。

許多CTC測序研究已經(jīng)強調(diào)了CTC的遺傳異質(zhì)性，這進一步增加了CTC癌癥生物學(xué)研究的復(fù)雜性。在CTC突變狀態(tài)中存在高的患者間和患者內(nèi)異質(zhì)性。通過檢測到的CTC體細胞核苷酸突變體（SNV）構(gòu)建腫瘤進化過程，并繪制早期干細胞突變（腫瘤演化早期存在的突變）具有相當(dāng)大的臨床應(yīng)用價值。然而，由于在大多數(shù)癌癥類型中捕獲的CTC數(shù)量有限，難以分析個體患者的SNV進化結(jié)構(gòu)。

而且，在癌癥進化期間，拷貝數(shù)變異（CNV）也經(jīng)常改變。對癌癥治療期間這些復(fù)雜體細胞突變的生物學(xué)影響的進一步研究將顯著促進我們對癌癥進展中CTC生物學(xué)的理解以及在疾病監(jiān)測領(lǐng)域的未來臨床應(yīng)用。

了解腫瘤進展期間發(fā)生改變的分子通路

以前的研究已經(jīng)強調(diào)了涉及癌癥轉(zhuǎn)移的特定分子通路，如TGF-β信號傳導(dǎo)，Wnt信號傳導(dǎo)和EMT。然而，大多數(shù)這些研究是基于小鼠模型或特定的生物標(biāo)志物。盡管存在顯著的ITH，分析CTC基因表達為了解在轉(zhuǎn)移過程中改變的分子通路提供了一個*的窗口。單細胞RNA測序的出現(xiàn)（scRNAseq）技術(shù)也使得能夠使用有限數(shù)量的分離的CTC獲得全面的基因表達和剪接信息。因此，CTC轉(zhuǎn)錄組測序為在癌癥進展期間數(shù)字化分子通路提供了*的機遇。

CTC測序的挑戰(zhàn)與未來展望

對CTC基因組或轉(zhuǎn)錄組進行測序面臨著巨大技術(shù)挑戰(zhàn)，獲得足夠的細胞進行文庫制備和測序是CTC測序的*個關(guān)鍵步驟。然而，根據(jù)不同的分離方法和癌癥類型的不同研究可以得出不同的結(jié)論。通常，獲得足夠的CTC進行測序仍然是大多數(shù)癌癥類型的重要問題，這限制了CTC測序研究的數(shù)量。此外，白細胞污染，缺乏特異性生物標(biāo)記物，低通量和耗時耗力的捕獲操作方案也阻礙了CTC測序研究的進展。獲得高質(zhì)量測序文庫是CTC測序中的另一關(guān)鍵步驟。

更重要的是，對CTC測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析需要額外的質(zhì)量評估和評估，特別是樣本和測序文庫制備過程中引入偏差的評估。基因組擴增期間的脫落（ADO）可能阻止檢測CTC體細胞突變等位基因， WGA方法的局限性可能導(dǎo)致基因組覆蓋率低，假陽性率高，突變檢測的靈敏度低，WGA中的不均一讀取分布和嵌合體也可能導(dǎo)致CNV和SV中的偽影 。

隨著先進的微流體方法的發(fā)展，一些新型的測序技術(shù)顯示出解決CTC測序技術(shù)障礙的希望。例如，科學(xué)家現(xiàn)在可以進行原位DNA或RNA測序。這種方法降低了樣品處理過程的復(fù)雜性以及在CTC富集和分離過程中可能發(fā)生的細胞損傷或損失。此外，新興的單分子測序技術(shù)有望在不擴增的情況下分析DNA或RNA分子。

參考文獻

1、Zhongyi Zhu & Si Qiu & Kang Shao & Yong Hou. Progress and challenges of sequencing and analyzing circulating tumor cells. Cell Biol Toxicol. https://doi.org/10.1007/s10565-017-9418-5.